Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

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EC0085ml(500T)$488.00

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常见问题

问 题 回 答
一个孔中应接种多少个细胞? 当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
能否用384孔板进行试验? 可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液,如果加入的CCK-8体积太少,可以先将CCK-8溶液稀释1倍,然后加入培养基体积20%的量。
能否用24孔板进行试验? 可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
酚红会影响检测吗? 不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性? 有。然而,请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此结果可能不同。
CCK-8能否检测细菌细胞? 可以检测E.coli,但不能检测酵母细胞。向100μl E.coli培养液中加入10μl CCK-8溶液,并培养1-4个小时或过夜。
CCK-8稳定吗? CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存,我们推荐-20℃的储藏条件。
如果没有450 nm的滤光片,还可以使用哪些其他滤光片? 还可使用450 nm到490 nm之间的滤光片。
如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差? 可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
CCK-8是什么颜色? 应该是粉红色。若颜色不一样,有可能会影响测定。
CCK-8能否对活细胞进行染色? 不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8),并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的,因此CCK-8不能对细胞进行染色。
CCK-8检测溶液对细胞是否有毒? CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是,加到培养基中的CCK-8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。因此,长时间的培养,如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决? 有时会有影响。如果药物具有还原性,会和CCK8发生显色反应,增加吸光度。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8,测定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。
每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决? 可能会有以下几个原因: 1. 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。 一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK-8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
如何设定空白对照? 在不含细胞的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。
哪些物质会影响CCK8的测定? 当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定,例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。
在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决? 可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如:可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
设定参比波长的目的是什么?必须设定吗? 不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板或12孔板,应该加多少量CCK-8试剂? 一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
在CCK-8显色过程中,如何终止反应? 有一下几种方法(96孔板): ①在显色反应后,将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl 0.1 M HCL溶液。③每孔加10μl的 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时之内测定。
必须预培养细胞吗? 不一定。如果要向保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
如果加入的药物中含有金属,是否会有影响? 金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话,将会100%抑制。
CCK-8试剂的保存条件? 在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话,推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收,从而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
预培养后,更换培养基需要细胞计数吗? 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样? 不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别? 悬浮细胞由于染色比较困那,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。
应该每次做标准曲线吗? 建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。
有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量? 不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。
实验之前,是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应? 需要,可用一个孔检测一下,因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
如果OD值太低,可以采取什么办法? 可以采取2个办法:① 适当增加细胞数量。② 延长加入CCK-8试剂后的染色时间。

储存

4℃避光保存一年有效,-20℃避光保存两年有效。

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